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技術(shù)文章
海南大學(xué)林桓副研究員團(tuán)隊(duì)以模式藍(lán)藻（細(xì)長(zhǎng)聚球藻 PCC 7942）為研究對(duì)象，與島津廣州分析中心展開深入合作，通過微流液相色譜儀（島津Nexera Mikros）結(jié)合三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（島津LCMS-8050）建立了一套兼具靈敏度與特異性的修飾核苷鑒定方法，并對(duì)細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC 7942 總tRNA組分中存在的修飾核苷進(jìn)行了檢測(cè)分析，為修飾核苷的鑒定提供了一種新思路。成果于2021年7月發(fā)表在《Journal of Separation Science》。
生物體中的RNA元件，包括核糖體RNA，信使RNA，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA，剪接體RNA，miRNA等，均需要經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄后修飾成為成熟的分子。這些修飾對(duì)實(shí)現(xiàn)RNA元件的功能至關(guān)重要，例如mRNA疫苗必須在RNA鏈上摻入修飾核苷才能在人體中穩(wěn)定表達(dá)。RNA轉(zhuǎn)錄后修飾主要發(fā)生在核糖核苷（A/U/C/G）的堿基或核糖上，以共價(jià)結(jié)合的方式連接一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)。近年研究表明RNA修飾種類和修飾率的變化參與到RNA代謝及功能實(shí)現(xiàn)的全過程，具有重要生理學(xué)意義[1-5]。
更高效的前處理技術(shù)以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的富集和基質(zhì)/雜質(zhì)的清除；
更*的分離手段，得到更純、更集中流出的色譜峰以提高目標(biāo)物的瞬間濃度；
更的檢測(cè)技術(shù)以提高目標(biāo)物信號(hào)響應(yīng)。
目前質(zhì)譜儀因其通用性高、選擇性好和靈敏度高，是主流的檢測(cè)技術(shù)，其中，靈敏度是評(píng)價(jià)質(zhì)譜等級(jí)的重要指標(biāo)之一。質(zhì)譜儀的靈敏度受多方面影響，其中可以通過降低進(jìn)入離子源的液流，有效提高離子化效率，從而較大提高質(zhì)譜檢測(cè)靈敏度。如目前比較常見的Nano液相、Micro液相和Semi-micro常規(guī)分析型液相，我們來做一下性能對(duì)比。
三種液相系統(tǒng)的性能對(duì)比
Nano液相的液量有利于LCMSMS離子源的去溶劑化，從而提高質(zhì)譜響應(yīng)。但是由于液流過低，其通量較小；另外，納升級(jí)的流速對(duì)輸液泵的精度和脈沖控制要求非常高，再加上其精密的部件對(duì)使用和維護(hù)都有很高的要求。故現(xiàn)有技術(shù)下Nano液相的通量和穩(wěn)定性無法達(dá)到常規(guī)分析型液相的水平。而Semi-micro常規(guī)型液相已成為相對(duì)成熟、應(yīng)用范圍相對(duì)廣的分析手段，這兩項(xiàng)指標(biāo)非常優(yōu)異，但是，由于較大的液流，導(dǎo)致進(jìn)入離子源，尤其是ESI離子源之后，其去溶劑化效率較差，靈敏度無法進(jìn)一步提高。 Micro液相的色譜柱內(nèi)徑介于0.1~1.0 mm之間，流速一般介于1~100 μL之間，流速下的儀器穩(wěn)定性、耐用性和維護(hù)性都比Nano液相有大幅提高，通量接近半微量分析型液相，而其去離子效率相比半微量分析型液相大大提高。因此Micro液相沒有明顯的短板，理論上是三種液相中相對(duì)理想的技術(shù)。
島津微流量液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng) Mikros-LC+LCMS-8060
在本研究中研究人員報(bào)道了尿苷及其衍生物在低溫及高有機(jī)溶劑的條件下容易析出造成信號(hào)變動(dòng)，指出了利用HILIC等親水原理的核苷酸LCMS分析中需要注意的問題。利用島津微流量液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)測(cè)試了總tRNA組分中24個(gè)核苷標(biāo)樣，確定了各個(gè)標(biāo)樣所用的母離子和子離子，以及在HILIC色譜柱中的保留時(shí)間。通過多反應(yīng)監(jiān)測(cè)及保留時(shí)間，可以區(qū)分這些修飾核苷及其同分異構(gòu)體。
核苷標(biāo)樣微流量液質(zhì)系統(tǒng)色譜圖
測(cè)定了24個(gè)修飾核苷標(biāo)樣的小檢出量，運(yùn)用微流液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀檢出下限為0.1-1 fmol，而一般用于鑒定修飾核苷所用的半微流液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀的檢出下限為1-10 fmol。
運(yùn)用上述建立的方法，對(duì)細(xì)長(zhǎng)聚球藻 PCC 7942中的修飾核苷進(jìn)行定量檢測(cè)，僅需含25 ng總tRNA組分的樣品，即可得到清晰的質(zhì)譜結(jié)果，而在傳統(tǒng)的半微流液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀上得到相同結(jié)果，至少需要含100 ng的總tRNA組分的樣品[6, 7]。
細(xì)長(zhǎng)聚球藻樣品圖
海南大學(xué)林桓副研究員：修飾核苷中尿嘧啶核苷及其衍生物電離困難及各修飾核苷同分異構(gòu)體之間不易區(qū)分的特點(diǎn)一直是質(zhì)譜檢測(cè)的難點(diǎn)。同時(shí)常規(guī)的半微流液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀檢出限較高，需要的樣品量較大，這也是不易提取的樣品檢測(cè)的制約條件之一。該研究依托島津公司強(qiáng)大的質(zhì)譜分析平臺(tái)，使用微流液相色譜—三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀分離鑒定總tRNA組分中的修飾核苷，靈敏度較半微流液相色譜——三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀提高了10倍以上。該方法可支持表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)的發(fā)展。
【參考文獻(xiàn)】
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