一、定性分析

在高效液相色譜中，常用的定性分析有下列五種方法。

1、利用已知標(biāo)準(zhǔn)樣定性

由于每一種化合物在特定的色譜條件下有其特定的保留值，如果在相同的色譜條件下，被測(cè)物與標(biāo)樣的保留值相同，則可初步認(rèn)為被測(cè)物與標(biāo)樣相同。

2、利用紫外和熒光光譜定性

由于不同的化合物有其不同的紫外吸收或熒光光譜，對(duì)檢測(cè)池中的待檢樣品進(jìn)行全波長(zhǎng)（180～800nm）掃描，得到紫外可見光或熒光光譜圖；再用相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品，按同樣方法處理，也得到一個(gè)光譜圖，比較這兩張圖譜，即可鑒別該樣品是否與標(biāo)準(zhǔn)品相同。對(duì)于某些有特征光譜圖的化合物，也可以與所發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)圖譜來比較以進(jìn)行定性。

3、收集柱后流出組分，再用其他化學(xué)或物理方法定性

液相色譜常用化學(xué)檢測(cè)器，被測(cè)物經(jīng)過檢測(cè)器后不受破壞，所以可以收集各組分，然后再用紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振等方法進(jìn)行鑒定。

4、HPLC 指紋圖譜分析法

HPLC 指紋圖譜分析法是指紋圖譜與 HPLC 相結(jié)合的一種分析方法，目前已成為中藥質(zhì)量控制的方法，適用于中藥復(fù)雜成分的分離、分析和指紋圖譜的建立。在食品上主要用于天然成分的分析。被分離、分析物質(zhì)預(yù)處理后用HPLC 測(cè)定出色譜峰，經(jīng)過計(jì)算機(jī)庫存信號(hào)的檢索及對(duì)質(zhì)譜圖的解析，對(duì)所含成分做出定性鑒定。

5、建立液相色譜定性方法

可根據(jù)以下幾點(diǎn)，建立合理的液相色譜分析方法：選擇合適的分析樣品的液相色譜方法；選擇合適的柱子；選擇合適的k（峰容量因子）的條件；確定良好的峰位（α）；選擇良好的柱條件（最佳 N 值）。

根據(jù)樣品的情況，如分子量是大于2000還是小于2000，樣品是溶于水還是不溶于水，確定選擇何種液相方法。

選擇溶劑強(qiáng)度配成適宜的流動(dòng)相，以得到理想的k，使k盡量在1～10的范圍內(nèi)（特殊情況也允許0.5<k<20）。溶劑的黏度也很重要，一般黏度要小于2×10-3Pa·s。

二、定量分析

在高效液相色譜分析中常用的定量分析方法有外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法。

1、外標(biāo)法

外標(biāo)法是以被測(cè)化合物的純品或已知其含量的標(biāo)樣作為標(biāo)準(zhǔn)品，配成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，注入色譜儀，得到的響應(yīng)值（峰高或峰面積）與進(jìn)樣量在一定范圍內(nèi)成正比。用標(biāo)樣濃度對(duì)響應(yīng)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算回歸方程，然后用被測(cè)物的響應(yīng)值求出被測(cè)物的量。

2、內(nèi)標(biāo)法

內(nèi)標(biāo)法是在樣品中加入一定量的某一物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行的色譜分析，被測(cè)物的響應(yīng)值與內(nèi)標(biāo)物的響應(yīng)值之比是恒定的，此比值不隨進(jìn)樣體積或操作期間所配制的溶液濃度的變化而變化，因此可得到較準(zhǔn)確的分析結(jié)果。

具體操作步驟如下。

（1）先準(zhǔn)確稱取被測(cè)組分 a 的標(biāo)樣 Wa內(nèi)標(biāo)物，加入一定量溶劑混合，即得混合標(biāo)樣。取任意體積（μL）注入色譜儀，得色譜峰面積Aa（被測(cè)組分a標(biāo)樣峰面積）及峰面積As（內(nèi)標(biāo)物峰面積），用下式計(jì)算相對(duì)響應(yīng)因子Sa。

（2）稱取被測(cè)物W，然后加入準(zhǔn)確稱重的內(nèi)標(biāo)物W's，加入一定體積的溶劑混合。取任意體積（μL）注入色譜儀，測(cè)得被測(cè)組分a的峰面積A'a，內(nèi)標(biāo)物峰面積為A's。按下式計(jì)算被測(cè)物中 a 組分的質(zhì)量W'a。

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